ARTÍCULOS ORIGINALES
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Salud Mil 2023; 42(1):1-19. https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
(a) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
(b) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
(c) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
(d) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
(e) Nuclear Medicine Medical Investigation Laboratory LIM43-Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo - HCFMUSP, São Paulo, Brazil.
(f) Nuclear Medicine Medical Investigation Laboratory LIM43-Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo - HCFMUSP, São Paulo, Brazil.
(g) Laboratório de Oncologia Experimental, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Av. Dr.
Arnaldo Nº 455 - Cerqueira César - CEP: 01246903, São Paulo, Brazil.
https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
Recibido para evaluación: enero 2023
Aceptado para publicación: marzo 2023
Correspondencia: Ximena Camacho. Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias,
Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Mataojo 2055, C.P. 11400, Montevideo, Uruguay. Tel: (+598) 294921199.
E-mail de contacto: xcdamata@gmail.com
Ximena Aida Camacho Damata a
María García i
Camila María Longo Machado e
Roger Chammas m
Mirel Cabrera c
Carlos Buchpiguel k
Mara de Souza Junqueira g
Juan Pablo Gambini o
Carolina Perroni b
Marcelo Luis Fernández Lomonaco j
Camila de Godoi Carneiro f
Eloisa Riva n
Marcos Tassano d
Hugo Cerecetto l
Daniele Faria de Paula h
Pablo Cabral p
https://orcid.org/0000-0002-0755-3834
https://orcid.org/0000-0002-2918-5761
https://orcid.org/0000-0001-6122-1147
https://orcid.org/0000-0003-0342-8726
https://orcid.org/0000-0002-5225-1106
https://orcid.org/0000-0003-0956-2790
https://orcid.org/0000-0002-2404-6543
https://orcid.org/0000-0001-5368-3464
https://orcid.org/0000-0002-6790-4851
https://orcid.org/0000-0002-5036-1459
https://orcid.org/0000-0002-6547-398X
https://orcid.org/0000-0002-4750-034X
https://orcid.org/0000-0001-6685-4656
https://orcid.org/0000-0003-1256-3786
https://orcid.org/0000-0002-1766-2786
https://orcid.org/0000-0001-7344-2027
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de
imagen en mieloma múltiple
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab (Bevacizumab): seu uso como agente de imagem em
mieloma múltiplo.
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): its use as an imaging agent in Multiple
Myeloma.
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
2
RESUMEN
Introducción: el mieloma múltiple es un trastorno hematológico maligno y el segundo cáncer de la san-
gre más frecuente. El proceso de la angiogénesis tumoral es fundamental para el crecimiento y me-
tástasis de muchos tipos de tumores, incluido en mieloma múltiple. Se sabe que la sobreexpresión del
factor de crecimiento endothelial vascular se encuentra asociado a un mal pronóstico en esta patología,
representando un blanco clave para la terapia anti-angiogénica en mieloma múltiple. El anticuerpo mo-
noclonal Bevacizumab es capaz de unirse con gran anidad al factor de crecimiento endothelial vascular
bloqueando su acción.
Objetivo: evaluar el Fab(Bevacizumab) marcado con 99mTc o Cy7 como potenciales agentes de ima-
gen moleculares de la expresión de factor de crecimiento endothelial vascular en mieloma múltiple.
Material y métodos: la expresión de factor de crecimiento endothelial vascular fue analizada mediante
citometría de ujo en la línea celular huaman de mieloma múltiple, la MM1S. Fab(Bevacizumab) fue pro-
ducido mediante digestión de Bevacizumab con papaína, conjugado a NHS-HYNIC-Tfa y radiomarcado
con 99mTc. Se realizaron estudios de biodistribución y de tomografía computarizada por emisión del fotón
simple. A su vez, Fab(Bevacizumab) fue marcado con Cy7 para obtener imágenes de uorescencia in
vivo hasta 96 horas.
Resultados: el análisis por citometría de ujo en la línea celular MM1S reveló que la expresión de factor
de crecimiento endothelial vascular es predominantemente intracelular. Los estudios de biodistribución y
SPECT/CT del complejo 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) mostraron una rápida eliminación sanguínea y
una signicativa captación a nivel renal y tumoral. Las imágenes por uorescencia empleando Cy7-Fab
(Bevacizumab) permitieron la visualización tumoral hasta 96 h p.i.
Conclusiones: logramos visualizar la expresión de factor de crecimiento endothelial vascular in vivo en
mieloma múltiple mediante el empleo del fragmento Fab del anticuerpo anti-VEGF (Bevacizumab) marcado
con 99mTc y Cy7. Estos nuevos agentes de imagen molecular podrían ser empleados potencialmente en el
ámbito clínico para la estadicación y el seguimiento de pacientes con mieloma múltiple, mediante la visua-
lización radioactiva in vivo de la expresión de factor de crecimiento endothelial vascular en todo el cuerpo.
La imagen óptica de estos trazadores mejoraría el muestreo tumoral y podría guiar la extirpación quirúrgica.
PALABRAS CLAVE: Fab(Bevacizumab); Factor de Crecimiento Endotelial Vascular; Imagenología Molecular;
Mieloma Múltiple; 99mTecnecio.
(h) Nuclear Medicine Medical Investigation Laboratory LIM43-Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de São o Paulo - HCFMUSP, São Paulo, Brazil.
(i) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
(j) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
(k) Nuclear Medicine Medical Investigation Laboratory LIM43-Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo - HCFMUSP, São Paulo, Brazil.
(l) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
(m) Laboratório de Oncologia Experimental, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Av. Dr.
Arnaldo Nº 455- Cerqueira César - CEP: 01246903, São Paulo, Brazil
(n) Clínica Hematológica. Hospital de Clínicas. Facultad de Medicina. Universidad de la República,
Montevideo, Uruguay.
(o) Centro de Medicina Nuclear e Imagenología Molecular, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina,
Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
(p) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de imagen en mieloma múltiple
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Salud Mil 2023; 42(1):1-19. https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
ABSTRACT
Introduction: Multiple myeloma is a hematologic malignancy and the second most common blood cancer.
The process of tumor angiogenesis is central to the growth and metastasis of many types of tumors,
including multiple myeloma. Overexpression of vascular endothelial growth factor is known to be associated
with poor prognosis in this pathology, representing a key target for anti-angiogenic therapy in multiple
myeloma. The monoclonal antibody Bevacizumab is able to bind with high anity to vascular endothelial
growth factor blocking its action.
Objective: To evaluate 99mTc- or Cy7-labeled Fab(Bevacizumab) as potential molecular imaging agents of
vascular endothelial growth factor expression in multiple myeloma.
Material and Methods: Vascular endothelial growth factor expression was analyzed by ow cytometry
in the multiple myeloma huaman cell line, MM1S. Fab(Bevacizumab) was produced by digestion of
Bevacizumab with papain, conjugated to NHS-HYNIC-Tfa and radiolabeled with 99mTc. Biodistribution and
single photon emission computed tomography studies were performed. In turn, Fab(Bevacizumab) was
labeled with Cy7 to obtain in vivo uorescence images up to 96 hours.
Results: Flow cytometry analysis in the MM1S cell line revealed that vascular endothelial growth factor
expression is predominantly intracellular. Biodistribution and SPECT/CT studies of the 99mTc-HYNIC-Fab
(Bevacizumab) complex showed rapid blood clearance and signicant renal and tumor uptake.
Fluorescence imaging using Cy7-Fab(Bevacizumab) allowed tumor visualization up to 96 h p.i.
Conclusions: We were able to visualize vascular endothelial growth factor expression in vivo in multiple
myeloma using the Fab fragment of the anti-VEGF antibody (Bevacizumab) labeled with 99mTc and Cy7.
These new molecular imaging agents could potentially be employed in the clinical setting for staging and
monitoring of patients with multiple myeloma by in vivo radioactive visualization of vascular endothelial
growth factor expression throughout the body. Optical imaging of these tracers would improve tumor
sampling and could guide surgical excision.
KEYWORDS: Fab(Bevacizumab); Vascular Endothelial Growth Factor; Molecular Imaging;
Multiple Myeloma; 99mTecnetium.
RESUMO
Introdução: o mieloma múltiplo é uma malignidade hematológica e o segundo câncer de sangue mais co-
mum. O processo de angiogênese tumoral é fundamental para o crescimento e a metástase de muitos tipos
de tumores, incluindo o mieloma múltiplo. Sabe-se que a superexpressão do fator de crescimento endotelial
vascular está associada a um prognóstico ruim no mieloma múltiplo, representando um alvo importante
para a terapia antiangiogênica no mieloma múltiplo. O anticorpo monoclonal Bevacizumab é capaz de se
ligar com alta anidade ao fator de crescimento endotelial vascular e bloquear sua ação.
Objetivo: avaliar o Fab(Bevacizumab) marcado com 99mTc ou Cy7 como possíveis agentes de imagem
molecular da expressão do fator de crescimento endotelial vascular no mieloma múltiplo.
Material e métodos: a expressão do fator de crescimento endotelial vascular foi analisada por citometria
de uxo na linha celular de mieloma múltiplo MM1S. O Fab(Bevacizumab) foi produzido pela digestão do
Bevacizumab com papaína, conjugado com NHS-HYNIC-Tfa e radiomarcado com 99mTc. Foram realizados
estudos de biodistribuição e tomograa computadorizada por emissão de fóton único. Por sua vez, o Fab
(Bevacizumab) foi marcado com Cy7 para geração de imagens de uorescência in vivo por até 96 horas.
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
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Resultados: a análise de citometria de uxo na linha celular MM1S revelou que a expressão do fator
de crescimento endotelial vascular é predominantemente intracelular. Os estudos de biodistribuição e
SPECT/CT do complexo 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) mostraram uma rápida depuração sanguínea
e uma captação renal e tumoral signicativa. A imagem de uorescência usando Cy7-Fab(Bevacizumab)
permitiu a visualização do tumor até 96 horas p.i.
Conclusões: conseguimos visualizar a expressão do fator de crescimento endotelial vascular in vivo no
mieloma múltiplo usando o fragmento Fab do anticorpo anti-VEGF (Bevacizumab) marcado com 99mTc e Cy7.
Esses novos agentes de imagem molecular poderiam ser usados no cenário clínico para o estadiamento
e o monitoramento de pacientes com mieloma múltiplo, visualizando radioativamente a expressão do
fator de crescimento endotelial vascular in vivo em todo o corpo. A geração de imagens ópticas desses
traçadores melhoraria a amostragem do tumor e poderia orientar a excisão cirúrgica.
PALAVRAS-CHAVE: Fab(Bevacizumab); Fator de Crescimento do Endotélio Vascular;
Imagens Moleculares; Mieloma Múltiplo; 99mTecnetium.
1. INTRODUCCIÓN
El mieloma múltiple (MM) es un trastorno hema-
tológico maligno caracterizado por la proliferación
clonal de células plasmáticas (CPs) en la médula
ósea (MO), producción de paraproteínas mono-
clonales en sangre y/o suero y la sobreproducción
de inmunoglobulinas monoclonales (1-5).
Se sabe que el MM es una enfermadad de las
CPs caracterizada por una estrecha relación en-
tre las células tumorales y el microambiente de la
MO, promoviendo el crecimiento y el desarrollo de
células mielomatosas (6). En los últimos años, se
ha demostrado que en enfermedades hematológi-
cas existe un incremento del proceso angiogénico
en el microambiente de la MO, incluyendo en MM,
demostrando un rol patosiológico potencial en
esta enfermedad. En MM, como en tumores só-
lidos, la progresión de la enfermedad se caracte-
riza por una etapa pre-angiogénica de progresión
tumoral lenta seguido por el “cambio angiogénico”
y un posterior estado angiogénico asociado con el
crecimiento tumoral progresivo (7).
Se ha demostrado que el proceso angiogénico
ocurre en la etapa de transición de gammapa-
tía monoclonal de signicado incierto (MGUS,
por sus siglas en inglés) tanto a MM quiescente
o asintomático como a MM activo o sintomático
(8,9).
La angiogénesis incrementada en la MO en MM
se encuentra sostenida por un desequilibrio entre
la producción de factores pro- y anti-angiogéni-
cos por parte de las células mielomatosas y célu-
las del microambiente. Las células mielomatosas
interaccionan con distintas células del microam-
biente de la MO (células estromales de la MO
(BMSC), broblastos, osteoblastos, osteoclastos,
linfocitos T, monocitos/macrófagos y mastocitos),
provocando la producción de factores de creci-
miento que favorecen su supervivencia; desenca-
denando la proliferación de las células endotelia-
les y el proceso angiogénico. Uno de los factores
producidos por las células mielomatosas y por
el microambiente, y que poseen un rol esencial
para inducir la angiogénesis en MM, es el fac-
tor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
Se ha demostrado que las células mielomatosas
son capaces de producir VEGF directamente
(10), siendo capaz de estimular la secreción de
VEGF por las células estromales de la MO, las
cuales sucesivamente inducen la producción de
VEGF por las células mielomatosas de forma pa-
rácrina (11-13).
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de imagen en mieloma múltiple
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Salud Mil 2023; 42(1):1-19. https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
Donde la sobreexpresión de VEGF en MM está
asociada a un mal pronóstico (7,14-17).
Actualmente la inhibición del proceso angiogéni-
co es empleado para el tratamiento de MM, por
ejemplo, mediante el empleo de Talidomida. Se
ha visto que durante el tratamiento con esta droga
los niveles del VEGF en la MO y en plasma dismi-
nuyen (18,19).
Por lo cual el bloqueo del VEGF sería una estrate-
gia adecuada para contrarrestar esta enfermedad.
Dicho bloqueo se puede lograr mediante el em-
pleo del anticuerpo Bevacizumab (rhuMAb-VEGF,
Avastin®, Genentech, USA). El Bevacizumab es
un anticuerpo monoclonal recombinante humani-
zado capaz de unirse a todas las isoformas del
VEGF humano con gran anidad (20,21).
El uso de este anticuerpo actualmente se en-
cuentra bien establecido en tumores sólidos,
como cánceres de colon y carcinomas de células
renales, y actualmente se encuentra en fase de
pruebas en tumores onco-hematológicos como
leucemia mieloide aguda y MM (9).
Muchas moléculas anti-angiogénicas han sido
radiomarcadas para producir un agente diagnós-
tico y/o terapéutico (22-31), con potencial para
detectar tumores emergentes, monitorizar las res-
puestas a tratamientos y predecir sus resultados;
así como también poder determinar aquellos pa-
cientes que podrían beneciarse de una terapia
anti-angiogénica. A su vez, estas moléculas po-
drían ser marcadas con un uoróforo para obte-
ner imágenes con alta resolución y a tiempo real
de la expresión a nivel tumoral de VEGF (29-31),
lo que permitiría guiar las intervenciones quirúr-
gicas. Los uoróforos NIR se han utilizado cada
vez más en este ámbito debido a que presentan
razonable penetración con baja autouorescencia
tisular (32,33).
Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este
trabajo fue desarrollar potenciales agentes de
imagen radiactivos y uorescentes para visuali-
zar la expresión de VEGF en MM. Para llevarlo
a cabo, marcamos Fab(Bevacizumab) con Cy7 y
con 99mTc mediante NHS-HYNIC-Tfa como agente
quelante bifuncional (AQB).
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1 Modelo celular de MM Humano
La línea celular humana de MM (MM1S) fue adqui-
rida de American Type Culture Collection (ATCC).
El medio base utilizado fue RPMI-1640 (Capricorn),
suplementadas con Suero Fetal Bovino (SFB) a una
concentración nal de 10%, 2 mM de L-glutamina,
100 U/mL penicilina y 100 µg/mL streptomicina. El
cultivo fue incubado a 37 °C con 5% de CO2 y una
atmósfera del 95% de humedad.
2.2 Bevacizumab Fab fragments production
Bevacizumab (AvastinTM, 25 mg/mL) producido
por Genetech, Inc., fue adquirido de Laboratorios
Roche, Uruguay.
Los fragmentos Fab fueron generados mediante
la digestión de Bevacizumab utilizando papaína
(Sigma-Aldrich, EE.UU.) según a lo descrito previa-
mente por nuestro grupo (34,35).
Brevemente, Bevacizumab (25 mg/mL) se hizo re-
accionar empleando una cantidad 1/10 (g/g) de pa-
paína (1 mg/mL) disuelto en un buer de reacción
(20 mM de fosfato sódico monobásico, 10 mM de
EDTA y 80 mM de clorhidrato de L-cisteína) durante
6 h a 37 °C, bajo agitación constante (225 rpm). Tras
la digestión, la mezcla de reacción fue centrifugada
a 200 g por 5 min hasta un volumen nal de 100 µl
y el sobrenadante fue eliminado; empleando un dis-
positivo de ultracentrifugación Centricom-30 (Sigma
Aldrich).
Por último, los Fabs fueron puricados por croma-
tografía de anidad empleando una columna de
proteína A (Pierce). La concentración de proteína se
midió a 280 nm y se ajustó a una concentración nal
de 1,0 mg/mL (36).
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
6
2.4 Unión del HYNIC al Fab(Bevacizumab),
radiomarcado con 99m-Tecnecio y controles
de calidad.
El agente quelante bifunciona NHS-HYNIC-Tfa
fue sintetizado y conjugado al Fab(Bevacizumab)
como fue descrito previamente por nuestro gru-
po (35-38).
Brevemente, fueron mezclados 0,213 μmol de
Fab(Bevacizumab) a temperatura ambien-
te (TA) durante 30 min con 0,33 μmol de
NHS-HYNIC-Tfa disuelto en 7,1 μL de
Dimetyilsufoxido (DMSO). El conjugado fue
puricado mediante cromatografía de ex-
clusión molecular (SEC) Sephadex G-25 y
Matrix-assisted laser desorption/ionization/
time-of-ight (MALDI TOF/TOF) lineal fue em-
pleado para determinar el nivel de conjugación.
La marcación de Fab(Bevacizumab)-HYNIC
con 99m-Tecnecio y los controles de calidad fue-
ron realizados como fue descrito previamente
por nuestro grupo (35-38).
Para ello, se mezclaron 44.6 mol de Tricina,
44.3 mol de SnCl2.2H2O y 6.7 nmol de Fab
(Bevacizumab)-HYNIC y se les adicionaron una
solución de Na99mTcO4 recién eluido. La mez-
cla fue incubada a TA por 30 min y la pureza
radioquímica fue evaluada por cromatografía
líquida de alta presión (HPLC). Los análisis por
HPLC fueron realizados empleando una colum-
na TSKgel G2000SW XL 7.8 mm x 30 cm (Tosoh
Bioscience, LLC, Japan) eluida con buer fosfa-
to 0.05 M (pH 7.0), modo isocrático (ujo 1 mL/
min); empleando el equipo Agilent 1200, equi-
pado con detectors de absorbancia UV y NaI(Tl)
(25-28, 34,35, 37,38).
La integridad de 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab)
fue analizada por medio de la incubación en
suero y en distintas concentraciones de
L-Cisteína a 37 °C.
2.3 Análisis por citometría de ujo
2.3.1 Tinción de la supercie
Tras disgregar el cultivo, las células fueron la-
vadas 3 veces en buer fosfato salino (PBS, 5
min a 600 g). Luego las células son jadas en
Paraformaldehyde (PFA) al 2% frío disuelto en
PBS e incubadas a 4 °C durante 15 min. Tras la -
jación, las células son bloqueadas durante 1 h a
4 °C con PBS-3% de seroalbúmina bovina (BSA)
y, a continuación, incubadas con 2 μg de
Fab(Bevacizumab)-Isotiocianato de uoresceína
(FITC) (2 mg/mL) en PBS-1% de BSA. Tras 2 h
de incubación en oscuridad a 37 °C, las células
fueron lavadas 3 veces con PBS (5 min, 600 xg).
Los datos fueron adquiridos en el citómetro
de ujo FACSCALIBUR® (BD Biosciences, San
Jose, CA, USA) y los datos fueron analizados
utilizando el software FlowJo (Becton Dickinson
& Company, Franklin Lakes, NJ, USA) (37).
2.3.2 Tinción intracelular
Tras disgregar el cultivo en PBS, jarlo en PFA
al 2% y lavarlo, las células fueron permeabili-
zadas emplenado 200 µl de Tween-20 al 0,2%
(v/v) disuelto PSA durante 30 min a 4 °C. Luego,
las células fueron lavadas 3 veces con PBS-1%
BSA (5 min, 600 xg) para eliminar el 0,2% (v/v)
de Tween-20 del medio, bloqueadas durante 1 h
a 4 °C con PBS-BSA 3% e incubadas con 2 μg
de Fab(Bevacizumab)-FITC durante 2 h a 37 °C
en oscuridad.
Por último, las células fueron lavadas 3 veces
con PBS (5 min, 600 xg). Los datos fueron ad-
quiridos y analizados como fue descrito previa-
mente en la sección 2.2.1.
Los controles para la tinción de supercie e in-
tracelular fueron células solas y control de isoti-
po-FITC (2 μg por cada ensayo) para determinar
los niveles de autouorescencia, y/o reacciones
inespecícas (37).
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de imagen en mieloma múltiple
7
Salud Mil 2023; 42(1):1-19. https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
y por tiempo) fueron inyectados por la vena
de la cola con aproximadamente 1.8 MBq del
Fab(Tocilizumab) radiomarcado puricados y
eutanizados por drogas anestésicas (xilazi-
na-100mg/Kg and ketamina-300 mg/Kg) luego
de 2 y 6 h. Los tejidos seleccionados (tumor,
corazón, hígado, pulmones, tiroides, riñones,
estómago, bazo, tracto gastrointestinal y veji-
ga) fueron extirpados, enjuagados de la sangre
residual, pesados y sus radiactividades medi-
das en un detector de NaI(Tl). La sangre y ori-
na fueron también colectados y medidos en el
contador gamma. La actividad en los órganos
o tejidos del tumor fue expresada como por-
centaje de actividad (% Act) y como porcenta-
je de actividad por gramo de tejido (% Act/g).
2.7 Conjugación de Fab(Bevacizumab) con
Cianina 7-NHS ester.7
Una solución de 2 mg/mL de Fab(Bevacizumab)
fue disuelta en 0.5 mL de NaCl 0.15 M y cen-
trifugados a 14000 g por 10 min at 4 °C em-
pleando un cartucho de centifugación Ami-
con Ultra 0.5 mL 10K MWCO (Sigma-Aldrich).
Posteriormente, el buer fue sustituido por
NaHCO3 0.1 M (pH 8.3) y esta solución con-
teniendo Fab(Bevacizumab) fue mezclada con
una solución de Cy7NHS-éster disuelto en
DMSO. La reacción fue incubada durante 2 h en
oscuridad. Para remover el Cy7-NHS libre, las
mezclas fueron centrifugadas a 14000g por 10
min a 4 °C. Luego, el buer de los conjugados
fue reemplazado por PBS 1X pH 7.4.
La concentración de proteínas en mg/mL fue
calculada según la siguiente:
mg/mL Proteina = (Abs280 - 0.04 x Abs747) / 1.4
La relación de Cy7:Fab(Bevacizumab) en el
conjugado nal fue calculado según la siguiente
fórmula:
Las mezclas de reacción fueron analizadas por
HPLC hasta 4 h.
2.5 Animales e inducción tumoral
La línea celular MM1S a una concentración
de 0,5 x 107 (con al menos un 95% de células
viables) fueron inyectadas por vía intravenosa
en ratones hembras BALB/c Nude, a nivel del
dorso del animal en la zona interescapular (sitio
denominado cruz del animal).
Los animales fueron controlados diariamente
durante al menos 1 mes evaluando el crecimien-
to tumoral. Todos los animales se mantuvieron
en jaulas ventiladas en estanterías ventiladas
(Alesco, Campinas, SP, Brasil) con alimento y
agua esterilizados a voluntad, en un ciclo de luz/
oscuridad de 12/12 h. Todos los procedimientos
estuvieron de acuerdo con los principios éticos
adoptados por el Colegio Brasileño de Experi-
mentación Animal y aprobados por el Comité
Ético de Investigación Animal de la Facultad de
Medicina de la Universidad de São Paulo (nú-
mero de aprobación del procedimiento 279/12).
Ratones BALB/c sanos, de 8-10 semanas de
edad (20-24 g), se obtuvieron del bioterio ani-
mal de la Universidad de la República, Uruguay.
Todos los animales se mantuvieron con comida
y agua ad libitum durante todo el experimento,
en un ambiente de temperatura y humedad con-
troladas. Todos los procedimientos estuvieron
de acuerdo con los principios éticos adoptados
por el Comité de Ética de Experimentación Ani-
mal de Uruguay (número de aprobación del pro-
cedimiento 240011-002308-14).
2.6 Estudios de biodistribución in vivo
La evaluación biológica in vivo del 99mTc-HY-
NIC-Fab(Bevacizumab) fue realizada por estu-
dios de biodistribución en ratones Balb/C nor-
males y Balb/C nude previamente inoculados
con células MM1S. Animales (n=5 por grupo
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
8
intravenosa en la vena de la cola de 18F-FDG,
(74-111 MBq/mice). Luego de 1 h, las imáge-
nes PET fueron adquiridas (tres adquisiciones
por lotes con 5 minutos cada lote) y reconstruí-
das con el softwere Triumph PET seguido de la
generación DICOM por el softwere Amira 4.1 (FEI
Visualization Sciences Group, Bordeaux, Zuse
Institute, Berlin, Germany) y la co-registración
fue analizada con el softwere Amide (39).
2.8.3 Imágenes por uorescencia
Las imágenes por uoresencia in vivo fueron
realizadas en ratones portadores de tumores
MM1S con Cy7-Fab(Bevacizumab) (100 µg)
hasta 96 h p.i. Se utilizó como control un ra-
tón Balb/c nude sano no inyectado con Cy7-Fab
(Bevacizumab). Las imágenes fueron adqui-
ridas empleando ltros de excitación de 745
nm y de emisión de 800 nm en una cámara
con dispositivo de acoplamiento de carga iVis
Spectrum (Perkin-Elmer). Las imágenes de
uorescencia fueron cuanticadas mediante
cuanticación de la eciencia radiante total
([fotones/s] / [µW/cm2]) utilizando el software
Living Image 4.3.1. Para realizar lose studios
de imagen por uorescencia todos los anima-
les fueron anestesiados con una mezcla de
isoflurano-oxígeno 1-2%.
2.9 Análisis estadísticos
Todos los datos fueron analizados mediante
ANOVA unidireccional seguido de pruebas post
hoc de Bonferroni con el programa GraphPad
Prism 4.0. Las diferencias fueron consideras
signicativas cuando p<0,5.
3. RESULTADOS
3.1 Análisis por citometría de ujo
En la gura 1 se observan los histogramas res-
pectivos de los análisis por citometría de ujo
realizados en la línea celular MM1S sin permea-
2.8 Imagenología molecular
2.8.1 Imágenes SPECT/CT
Las imágenes SPECT/CT (Single-photon
emission computed tomography/computed
tomography) fueron llevadas a cabo emplean-
do un equipamiento microPET/SPECT/CT
(Triumph, Trifoil Imaging Inc). Luego de 21 días
de la inoculación subcutánea de las líneas celu-
lares de MM (MM1S) en ratones hembras Balb/C
nude (BALB/c nu/nu), una mezcla de isouorano:
oxígeno de 2:2.5% fue usado para la aneste-
sia seguido de la inyección intravenosa de
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab)(74-185 MBq/
ratón). Todas las imágenes SPECT/CT fueron
adquiridas empleando un colimador ve pinhole
(0.8 mm de resolución espacial, 55 x 55 mm
campo trans-axial de visión, 64 proyecciones,
FOV=46mm) y reconstruídas con un ltro OSEM
de correción (5 interacciones con 8 subconjun-
tos) con un 20% de ventana-99mTc seguido de
la generación DICOM por el softwere Amira 4.1
(FEI Visualization Sciences Group, Bordeaux,
Zuse Institute, Berlin, Germany) y la co-re-
gistración fue analizada con el softwere Amide
(39).
2.8.2 Imágenes PET
Las imágenes PET fueron llevadas a
cabo empleando un equipamiento micro
PET/SPECT/CT (Triumph, Trifoil Imaging Inc).
Luego de 21 días de la inoculación subcutá-
nea de la línea celular de MM (MM1S) en rato-
nes hembras Balb/C nude (BALB/c nu/nu), una
mezcla de isouorano: oxígeno de 2:2.5% fue
usado para la anestesia seguido de la inyección
(εcy7 = 210000 cm-1 M-1)
Relación de Cy7/ Fab(Bevacizumab) =
(Abs747 x MWFab(Bevacizumab) / mg/mL
Proteina x εcy7
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de imagen en mieloma múltiple
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Salud Mil 2023; 42(1):1-19. https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
bilizar como permeabilizadas con Tween 20%,
empleando FITC-Fab(Bevacizumab). Se ob-
servó un incremento de la capacidad de unión
del FITC-Fab(Bevacizumab) al VEGF al ser
permeabilizadas las células. Por lo tanto, el
VEGF es detectado principalmente por tinción
intracelular, conrmando su expresión a dicho
nivel.
Al realizar un análisis comparativo de las inten-
sidades medias de uorescencias (IMF) Fab
(Bevacizumab) conjugado a FITC en la línea
celular de MM humano MM1S, se observó que
el fragmento no presenta un signicativo incre-
mento de la IMF cuando las células MM1S no
son permeabilizadas. Sin embargo, al ser per-
meabilizadas dichas células y de esta forma
lograr acceder a los antígenos intracelulares
de dichas células, el fragmento incrementa su
IMF debido al reconocimiento al VEGF (com-
parado al reconocimiento del control de isotipo
FITC-IgG1); esto demuestra la especicidad de
la unión del Fab (Bevacizumab) en dicha línea ce-
lular (gura 2).
Figura 1. Análisis por citometría de ujo en la línea celular MM1S A) sin permabilizar y B) permeabilizadas con
Tween empleando: control sólo células; control de isotipo y FITC-Fab(Bevacizumab).
Figura 2. Intensidad media de uorescencia (IMF) en
la línea celular MM1S sin permeabilizar y permeabiliza-
das con Tween empleando: control sólo células; con-
trol de isotipo FITC-IgG1 y FITC-Fab(Bevacizumab).
Mediante este estudio fue que nos alentó a ino-
cular esta línea celular para la inducción de tu-
mores de MM y realizar de esta forma los estu-
dios in vivo de biodistribución e imagenológicos.
3.2 Estudios in vivo de biodistribución
Los estudios de biodistribución in vivo en ra-
tones Balb/c normales y Balb/C nude por-
tadores de tumores de MM inducidos por la
inoculación de células MM1S se encuentran
resumidos en la Tabla 1 y en las guras 3 a 5.
Los niveles de radioactividad en sangre en ra-
tones normales fueron 0.69 ± 0.09% DI/g y 0.74
± 0.20% DI/g a las 2 y 6 h p.i. respectivamente;
mientras que la radiactividad sanguínea para
ratones BALB/c nude con tumores MM1S indu-
cidos fue de 3.13 ± 0.35% DI/g y 2.79 ± 0.50%
DI/g a 2 y 6 h p.i, respectivamente. Esto de-
muestra una menor eliminación sanguínea del
fragmento Fab radiomarcado en ratones nor-
males comparado a los portadores de tumores
inducidos, cuya diferencia podría deberse al
efecto de las células tumorales a nivel humoral.
Se observó una absorción renal (40.48 ± 0.80%
DI/g y 39.92 ± 0.63% DI/g a 2 y 6 p.i. respec-
tivamente) relacionada con la eliminación del
fragmento Fab radiomarcado en ratones Balb/c
normales. A 2 y 6 h p.i, 48.78 ± 0.63 y 37.27
± 0.48% DI de 99mTc-HYNI-Fab (Bevacizumab)
fue excretado por la orina.
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
10
La captación tumoral para los ratones Balb/C
nude portadores de tumores MM1S fue de 2.38
± 0.72% DI/g y 1.06 ± 0.18% DI/g a 2 y 6 h p.i.,
respectivamente.
Las relaciones tumor-versus-músculo de
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) en los ratones
Balb/C nude portadores de tumores MM1S fueron
5.68 y 2.94 a 2 y 6 h, respectivamente.
Valores similares de absorción renal y elimina-
ción por la orina fueron observados en los ratones
Balb/C Nude portadores de tumores inducidos.
Los datos de la biodistribución de la absor-
ción a nivel tumoral de los ratones Balb/C nude
portadores de tumores MM1S inducidos, re-
velaron una buena captación y retención de
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab).
Tabla 1. Estudios de biodistribución de 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) en ratones Balb/C normales y portadores
de tumores MM1S inducidos. Datos presentados como % DI/g (o % Act) ± desviación estándar (DS) (n=5). TI=Trac-
to intestinal.
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de imagen en mieloma múltiple
11
Salud Mil 2023; 42(1):1-19. https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
Figura 3. Biodistribución de 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) en ratones Balb/C normales y portadores de tumores
MM1S inducido (n=5% DI/g ± DS).
Figura 4. Biodistribución de 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) en ratones Balb/C normales y portadores de tumores
MM1S inducido (n=5,% DI ± DS).
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
12
3.3 Conjugación Cy7-Fab(Bevacizumab)
La concentración de Cy7-Fab(Bevacizumab)
obtenida fue 1.25 mg/mL y la relación de mo-
les Cy7/moles Fab(Bevacizumab) fue 2.25.
3.4 Imagenología molecular
3.4.1 Imágenes SPECT/CT y PET
Las imágenes SPECT-CT de 99mTc-HYNIC-Fab
(Bevacizumab) en ratones BALB/c normales
mostraron una elevada captación a nivel renal a
2 h, la cual concuerda con los estudios de bio-
distribución (gura 6.A). Luego de 24 h posterior
a la realización de la imagen PET se realizaron
las imágenes SPECT-CT de 99mTc-HYNIC-Fab
(Bevacizumab) a 0.5, 2 h y 6 al Ratón 1 (gura
6.B). Las imágenes de 18F-FDG en tres rato-
nes Balb/C nude portadores de tumores MM1S
inducido revelaron un aumento de la captación
a nivel de los linfonodos axilares (gura 7).
Las imagenes de SPECT-CT hasta 6 h en el ra-
tón 1 portador de tumores MM1S inducido, re-
velaron una apreciable captación a nivel de los
linfonodos axilares, vericando de esta forma la
captación que fuera observada en las imágenes
de 18F-FDG.
Figura 5. Relación Tumor/Músculo y Tumor/Sangre obtenidas de las biodistribuciones de 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab)
en ratones Balb/c nude portadores de tumores MM1S inducidos (n = 5).
Figura 6. A) Imágen SPECT/CT de 99mTc-HYNIC-Fab
(Bevacizumab) en raton Balb/C normal (control)
a 2 h post-inyección. B) Imágen SPECT/CT de
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) en ratón BALB/c
Nude portador de tumor MM1S inducido a 0.5, 2 y 6 h
post-inyección. Se observó una remarcable captación
a nivel renal (echas amarillas) que concuerda con los
estudios de biodistribución; como también una apre-
ciable captación del Fab(Bevacizumab) radiomarcado
a nivel de los linfonodos axilares (echas celestes).
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de imagen en mieloma múltiple
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Figura 7. Imágenes PET axiales y coronales a 1 h
post-inyección de 18F-FDG en 3 ratones BALB/c
Nude portadores de tumores MM1S inducidos. Se
observa un área de captación de 18F-FDG a nivel
de los linfonodos axilares (echas azules).
3.4.2 Imágenes por Fluorescencia
Los datos de las imágenes por uorescen-
cia de Cy7-Fab(Tocilizumab) se muestran en
la Figura 8. Las imágenes fueron realizadas
hasta 96 h p.i. de 100 ug/100 uL de Cy7-Fab
(Bevacizumab), revelando una clara uores-
cencia en el dorso del animal, en la zona inte-
rescapular (sitio denominado cruz del animal),
hasta 96 h p.i. y que aumenta con el tiempo.
Figura 8. Imágenes iVis hasta 96 h (IVIS Spectrum
In Vivo Imaging System, Perkin Elmer) en ratón nor-
mal Balb/C nude (usado como control) y en ratón
Balb/C nude portadores de tumor de MM inducido,
inyectado con 100 μg de Cy7-Fab(Bevacizumab).
Se observa una apreciable captación a nivel renal
(echas blancas) y a nivel tanto de la zona intes-
capular (sitio de inoculación de las células MM1S)
como a nivel de la médula espinal (echas amarillas).
4. DISCUSIÓN
Actualmente se sabe que el proceso angiogé-
nico posee un rol fundamental para el desa-
rrollo del MM mediante su estrecha relación
entre las células tumorales y su microambien-
te. Se ha demostrado que, en MM, las célu-
las tumorales son capaces de interaccionar
con células del microambiente provocando la
producción de factores de crecimiento que fa-
vorecen su supervivencia, en especial el fac-
tor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
Nuestro objetivo fue sintetizar y caracterizar
potenciales agentes de imagen moleculares
anti-VEGF basados en la marcación del frag-
mento de unión al antígeno (Fab), empleando
tanto un emisor gamma (como el 99mTc) como
un emisor de uorescencia (como el Cy7) de-
bido a nuestra experiencia en el marcado de
anticuerpos y Fab con ambos emisores (25-
28,34,35,37,38), los cuales se podrían emplear
como métodos diagnósticos para la evaluación
de los niveles de expresión de VEGF en MM.
Se ha descrito que la línea celular de mielo-
ma múltiple MM1S expresa VEGF (40-42),
por lo que esta línea celular fue emplea-
da para la caracterización in vitro de
Fab(Bevacizumab) marcado con FITC a n de
conrmar su anidad y especicidad de unión
al VEGF. Los análisis de citometría de ujo
realizados con FITC-Fab(Bevacizumab) re-
velaron diferencias en el nivel de expresión
entre el VEGF unido a membrana y el intra-
celular, demostrando claramente que en esta
línea celular analizada este factor se expresa
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
14
principalmente de forma intracelular. Me-
diante estos estudios fue por lo que nos de-
cidimos emplear la línea celular MM1S para
ser inyectada en ratones BALB/c Nude y
de esta forma que sea empleado como mo-
delo para los ensayos biológicos in vivo.
La estabilidad in vivo fue vericada a través
de estudios de biodistribución e imagenoló-
gicos en ratones BALB/c normales y BALB/C
Nude portadores de tumores inducidos me-
diante la inoculación de células de MM, MM1S.
Los estudios de biodistribución que llevamos a
cabo empleando 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab)
en ratones BALB/C Nude portadores de tumo-
res MM1S, se observó una rápida depuración
sanguínea, con eliminación renal principal-
mente, y ausencia de captación apreciable en
otros órganos. La eliminación renal, se puede
explicar en base a que los productos de meta-
bolización de los Fab (con un peso molecular
aproximado de 50 kDa) pueden ser ltrados
por el glomérulo renal unido al radionucleido.
Se observó que aproximadamente el 50% de
la radioactividad inyectada fue eliminada en la
orina y vejiga a 2 h p.i. Los estudios de biodis-
tribución y las imágenes SPECT/CT realizadas
en ratones BALB/c Nude portadores de tumores
MM1S inducidos, nos permitieron apreciar una
signicativa captación tumoral. Estos resulta-
dos nos hacen considerar que a 2 h post-inyec-
ción sería el mejor momento para la realización
de imágenes SPECT/CT en ratones portado-
res de tumores MM1S inducidos, debido a que
se obtienen las mayores relaciones tumor-vs-
músculo (relación 5.68 a 2 h p.i) del comple-
jo del fragmento radiomarcado. Al realizar la
comparación entre las imágenes 18F-FDG y
SPECT/CT en ratones MM1S, se observó la
misma área de captación a nivel de los linfono-
dos empleando ambas técnicas, pero las imá-
genes SPECT/CT empleando 99mTc-HYNIC-Fab
(Bevacizumab) revelaron una mejor resolución.
La conjugación del fragmento Fab con Cy7, se
realizó de forma rápida y sencilla, obteniendo
un adecuado rendimiento de conjugación que
se encuentra dentro del rango esperado para di-
chos compuestos y proteínas. Las imágenes en
el iVIS obtenidas en ratones con MM inducidos
vericaron, al igual a lo observado en los estu-
dios de biodistribución e imágenes SPECT/CT
empleando un emisor gamma, los mismos per-
les de eliminación de los compuestos marcados
como también la efectiva retención a nivel tu-
moral como de su diseminación hacia los linfo-
nodos axilares. Dichas retenciones fueron veri-
cadas hasta 96 h posteriores a la inyección del
fragmento marcado con Cy7, respectivamente,
tanto a nivel del sitio de inoculación de las célu-
las como a nivel de los linfonodos axilares. Di-
chas captaciones a nivel de los linfonodos axia-
res se podría deber a que son lugares de muy
alta probabilidad de migración de células tumo-
rales para su posterior diseminación hacia otros
sitios. Estas nuevas sondas uorescentes po-
drían ser emplear para guiar la extirpación qui-
rúrgica de tumores que sobreexpresen VEGF.
El VEGF, molécula blanco del anticuerpo mo-
noclonal Bevacizumab, no sólo es el regulador
central de la angiogénesis tumoral sino también
juega un rol importante en la siología de la vas-
culatura normal. Su expresión se ha observado
en el parénquima de varios órganos de animales
sanos, los que incluyen riñones, hígado, pulmo-
nes y bazo (43); y, por lo tanto, es esperado que
agentes cuyo blanco sea el VEGF se unan también
a tales tejidos no tumorales de forma inespecíca.
Estos resultados nos permitirían creer que
el fragmento de unión al antígeno (Fab) del
Bevacizumab podría ser utilizado como un nue-
vo agente de imagen molecular. Siendo útiles a
la hora de proporcionar información relevante del
nivel de expresión del VEGF antes y después
de realizada una quimioterapia, lo que podría
mejorar las terapias antitumorales actuales. El
empleo de la imagenología molecular nos permi-
te monitorear a tiempo real la respuesta tumoral
a la terapia de una forma no invasiva, bene-
99mTc-HYNIC/Cy7-Fab(Bevacizumab): su empleo como agente de imagen en mieloma múltiple
15
Salud Mil 2023; 42(1):1-19. https://doi.org/10.35954/SM2023.42.1.4.e302
ciando nuestra comprensión de los mecanismos
que subyacen el crecimiento del tumor, su mi-
croambiente y su respuesta a la quimioterapia.
Por todo lo anterior, es claro que el fragmento
Fab del Bevacizumab congura una potencial
herramienta como estrategias de imagen mo-
lecular de la expresión del VEGF en tumores
oncohematológicos de una forma no invasiva.
Creemos que estos fragmentos Fab de anti-
cuerpos monoclonales uorescentes y radio-
marcados tienen un gran potencial diagnóstico
y terapéutico que todavía no se ha explorado.
5. CONCLUSIONES
El MM es una enfermedad frecuente y mortal,
y la imagenología molecular es empleada para
monitorear su progresión.
Nuevos agentes de imágenes para MM nos
podrían ayudar a comprender mejor el rol
del microambiente en esta enfermedad. Te-
niendo en cuenta este hecho, hemos desa-
rrollado con éxito agentes de imagen ba-
sados en el empleo del fragmento de unión
al antígeno (Fab) del Bevacizumab marca-
do con 99mTc y Cy7 para su uso como blan-
cos de la expresión de VEGF in vivo en MM.
Esperamos que estos nuevos agentes de
imagen moleculares abran el camino hacia
nuevas estrategias diagnósticas y terapéu-
ticas de MM; pudiendo contribuir a la deci-
sión de seguir o no con los tratamientos qui-
mioterapéuticos o radioterapéuticos dados
el alto costo que el uso de éstos conlleva.
Estos nuevos trazadores desarrollados podrían
ser vistos como herramientas clínicas para la
realización de estudios de screening del VEGF
en tumores que podrían responder a la qui-
mioterapia asociada al uso de Bevacizumab.
A su vez, la imagenología óptica de estos traza-
dores podría mejorar tanto el muestreo tumoral
como también guiar la extirpación quirúrgica.
Aprobación ética y consentimiento de parti-
cipación
Todos los procedimientos fueron aprobados por
el Comité Ético de Investigación Animal de la
Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo (número de aprobación del procedimiento
279/12), Brasil, y por el Comité Uruguayo de Éti-
ca en Experimentación Animal (número de apro-
bación del procedimiento 240011-002308-14),
Uruguay.
FINANCIACIÓN
Este trabajo contó con el apoyo de la Agen-
cia Nacional de Innovación e Investigación
(Uruguay) [POS_NAC_2015_1_109490] y la
Comisión Sectorial de Investigación Cientí-
ca-Universidad de la República (Uruguay)
[240600-000148-18].
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a Pro.In.Bio (Uruguay),
PEDECIBA Química (Uruguay), Agencia Nacio-
nal de Innovación e Investigación (Uruguay) y
Comisión Sectorial de Investigación Cientíca -
Universidad de la República (Uruguay).
DECLARACIÓN DE CONFLICTOS DE INTERESES
Los autores no reportan ningún conicto de interés.
El estudio se realizó con recursos propios de
los autores y/o la institución a la que representan.
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CONTRIBUCIONES AL MANUSCRITO:
(a) Concepción, diseño, adquisición de datos,
análisis de datos, interpretación y discu-
sión de resultados, redacción y revisión crí-
tica, y aprobación de la versión nal.
(b) Diseño, adquisición de datos.
(c) Diseño, adquisición de datos.
(d) Diseño, adquisición de datos, análisis de
datos.
(e) Diseño, adquisición de datos.
(f) Diseño, adquisición de datos.
(g) Diseño, adquisición de datos.
(h) Diseño, adquisición de datos, análisis de
datos, interpretación y discusión de resul-
tados.
(i) Diseño, adquisición de datos.
(j) Diseño, adquisición de datos.
(k) Diseño, adquisición de datos.
(l) Diseño, interpretación y discusión de resul-
tados.
(m) Diseño, análisis de datos, interpretación y
discusión de resultados.
(n) Diseño, análisis de datos; interpretación y
discusión de resultados.
(o) Diseño, análisis de datos; interpretación y
discusión de resultados; redacción y revi-
sión crítica.
(p) Concepción, diseño, análisis de datos, in-
terpretación y discusión de resultados,
redacción y revisión crítica.
NOTA: este artículo fue aprobado por el
Comité Editorial.
